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髓過氧化物酶(MPO)測試盒說明書（100T/48樣）

一．試劑組成與配制：（100T/48樣）

試劑一：緩沖貯備液35ml X 1瓶，4℃保存6個月

         緩沖應(yīng)用液的配制：  貯備液：雙蒸水=1:9，按需要量配制，4℃保存1個月。

試劑二： 粉劑X2支，4℃保存6個月。臨用時每支加緩沖應(yīng)用液60ml溶解，可以37℃加熱溶解，4℃保存2周。

【注】若您所需測的是組織樣本，并且除髓過氧化物酶之外，還需測其他項目時，此時每支試劑二粉劑需配成濃縮一倍的溶液，即每支試劑二粉劑加到緩沖應(yīng)用液30ml中。

試劑三： 粉劑 X3支，溶劑6mlX3支，4℃保存6個月。用時1支粉劑倒入1支溶劑中溶解，提前一天配制，充分溶解后4℃保存2周。

試劑四：溶液24mlX1瓶，天冷時會凝固。用前放入37℃以上的水中搖晃使其溶解至透明后方可應(yīng)用，室溫保存6個月。

試劑五：粉劑X2支，4℃保存6個月。

試劑六：溶液0.5mlX1支，4℃保存6個月。

     顯色劑的配制：臨用時將試劑五粉劑1支加到100ml緩沖應(yīng)用液中，充分搖勻，待粉劑*溶解后再加入試劑六0.1ml，充分混勻，配制好的顯色劑4℃避光保存。

試劑七：溶液6ml X1支，4℃保存6個月。

二．組織樣本的MPO測定

（一）、樣本前處理

       1.準確稱取組織重量，以配制好的試劑二溶液為勻漿介質(zhì)，按重量體積比為1:19加勻漿介質(zhì)制備成5%的組織勻漿，不需要進行離心。

【注】：若您除做髓過氧化物酶之外，還需要測其他指標(biāo)時，則組織勻漿制備要按下面方法：

1.試劑二配制時要濃縮一倍，即每支試劑二粉劑加到30ml緩沖應(yīng)用液中；

2.先用生理鹽水為勻漿介質(zhì)按實驗方法學(xué)制成濃縮一倍的勻漿，即10%勻漿（腦組織制備成20%勻漿），不要離心，取出部分濃縮一倍勻漿按1:1比例加入濃縮一倍的試劑二溶液，混勻后再進行測定。

2.取5%組織勻漿0.9ml加3號試劑0.1ml，（如果組織勻漿量不夠，可以按9:1的比例減少組織勻漿及3號試劑的用量），充分混勻后37℃水浴15分鐘，取出后待測。

（二）、操作表：

混勻，60℃水浴10分鐘，取出后立即在460nm處，1cm光徑，雙蒸水調(diào)零，測各管吸光度值。

注1： 天冷時，反應(yīng)液會出現(xiàn)凝固狀態(tài)，吸光度上升，您可以用25 - 37℃水浴箱或取一個盛25 - 37℃熱水的燒杯放在比色機旁邊，將各待測管一次放入水浴箱或燒杯中1 - 2 分鐘，待凝固消失后即可進行比色。

注2：混勻時，用漩渦混勻器，使液體上下充分混勻（一定要使zui下面液體也能旋轉(zhuǎn)到上面，建議不要用尖底的管子做，尤其不可用1.5ml的EP管，因為這樣非常難混勻）

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（三）、計算：

1.酶活力單位定義：每克組織濕片在37℃的反應(yīng)體系中，H2O2被分解1umol為1個酶活力單位。

2.計算公式：MPO活力=

3.計算舉例：

例一：取5%的小鼠心肌勻漿0.2ml按上述步驟進行檢測，測得對照管吸光度為0.030，測定管吸光度為0.164，則計算如下：

例二：取5%的大鼠肝勻漿0.2ml按上述步驟進行檢測，測得對照管吸光度為0.028，測定管吸光度為0.183，則計算如下：

例三：取10%的大鼠肝勻漿0.2ml按上述步驟進行檢測，測得對照管吸光度為0.002，測定管吸光度為0.012，則計算如下：

【注】*11.3為斜率的倒數(shù)

      ** 取樣中所含組織濕片的量（克）

     *** 0.05為5%的組織勻漿，即5克組織/100ml組織勻漿。

**** 0.2為取樣量0.2ml。

• 血清（漿）樣本中MPO測定

（一）、血清（漿）樣本前處理：

   1、 取血清（漿）與試劑二按1:1比例稀釋，充分混勻。

  2.取上面的混合液0.9ml加3號試劑0.1ml，（如果混合液量不夠，可以按9:1的比例減少混合液及3號試劑的用量），充分混勻后37℃水浴15分鐘。

（二）、操作表：

混勻，60℃水浴10分鐘，取出后立即在460nm處，1cm光徑，雙蒸水調(diào)零，測各管吸光度值。

注1:天冷時，反應(yīng)液會出現(xiàn)凝固狀態(tài)，吸光度上升，您可以用25~37℃的水浴箱或取一根盛25~37℃熱水的燒杯放在比色機旁邊，將各代測管一次放入水浴箱或燒杯中1~2分鐘，待凝固消失后即可進行比色。

注2：混勻時，用漩渦混勻器，是液體上下充分混勻（一定要使zui下面液體也能旋轉(zhuǎn)到上面，建議不要用尖底的管子做，尤其不可用1.5ml的EP管，因為這樣非常難混勻）

（三）、計算：

1、酶活力單位定義：每升血清（漿）在37℃的反應(yīng)體系中H2O2被分解1umol為1個酶活力單位。

2、計算公式：

3、計算舉例：

        取0.45ml的血清加0.45ml的試劑二充分混勻，再加0.1ml的試劑三，再充分混勻，37℃水浴15分鐘后，取0.2ml做檢測，測得測定管OD值0.053，對照OD值0.013，則計算如下：

注：*     11.3為斜率的倒數(shù)

    **    取樣中所含血清的量（升）

    ***   0.45為血清的量

    ****  0.2為取樣量0.2ml

四、測定原理：

        中性白細胞中存在有髓過氧化物酶 ，每個細胞中所含的酶的量是一定的，約占細胞干重的5%，該酶具有使過氧化氫還原的能力，利用這一特點可以分析酶的活力，并定量測定中性白細胞的數(shù)目。其原理如下：

MPO+H2O2→復(fù)合物；復(fù)合物+AH2(供氫體) →H2O+MPO+A產(chǎn)物

通過供氫體鄰連茴香胺供氫后生物試劑黃色化合物，在460nm處通過比色測定A產(chǎn)物的生成量，從而推算出MPO的活力以及H2O2減少的量和白細胞的數(shù)目。

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